人脐带间充质干细胞移植治疗大鼠深静脉血栓(5)

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Funding:Jiangsu Province Medical Innovation Team, No. Su Wei Ke Jiao(2017)1 (to ZYQ)

Wang Yan, Master candidate,Medical College of Nantong University, Nantong ,Jiangsu Province, China

王燕，女，1994 年生，江苏省南通市人，汉族，南通大学医学院妇产科学在读硕士，主要从事妊娠期静脉血栓栓塞症方面的研究。

稿件接受：2019-02-23

致谢：感谢张玉泉导师的指导和帮助，感谢南通大学动物实验中心老师及南通大学附属医院病理科老师的帮助。

作者贡献：实验设计及成文为王燕。实验实施为王燕及施沁。实验指导及文章审校为张玉泉。

利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。

伦理问题：实验方案经南通大学动物实验伦理委员会批准，批准号为-001，批准时间：2018-04-01。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。

写作指南：文章的撰写与编辑修改后文章遵守了《动物实验体内实验研究报告规范指南》(ARRIVE 指南)。

文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3次查重。

文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合本刊发稿宗旨。

作者声明：

文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。

开放获取声明：这是一篇开放获取文章，根据《知识共享许可协议》“署名-非商业性使用-相同方式共享4.0”条款，在合理引用的情况下，允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献，并为之建立索引，用作软件的输入数据或其他任何合法用途。

文章快速阅读：文题释义：脐带间充质干细胞：人脐带间充质干细胞是来源于发育早期中胚层和外胚层的一类多能干细胞，具有自我增殖及多向分化、免疫调节、归巢、旁分泌、组织修复及促血管新生等特性，严格意义上其来源分4种，即华通氏胶、脐血、脐血管及脐血管周围细胞，实验采用脐带华通氏胶源性间充质干细胞。血栓溶解、机化及再通：在血栓形成后，纤维蛋白溶解酶激活以及血栓内白细胞释放溶蛋白酶，较小的血栓可以被完全溶解吸收，若血栓较大或纤维蛋白溶解酶活性不足，存留的血栓则发生机化及再通。内皮细胞、成纤维细胞和炎性细胞从血管壁长入血栓，由肉芽组织逐渐取代血栓的过程，为血栓机化。过程中，血管内皮细胞长入并被覆于血栓内裂隙表面，形成新的血管，相互吻合成新的管腔，血流部分恢复，这一过程称为再通。0 引言 Introduction深静脉血栓是一类具有较高发生率和病死率的血管性疾病。快速的血栓清除以及管腔血流恢复以减少静脉瓣膜的损害和持续的静脉高压，对降低血栓后综合征的发病率至关重要[1-2]。因此，探讨一种在深静脉血栓形成后，加速其机化及溶解再通，同时能规避早期溶栓出血等不良反应的治疗方法是亟需解决的问题。血栓机化、溶解及再通过程中，3个关键的因素共同发挥作用[3-4]：炎性细胞浸润、纤维蛋白溶解及新血管生成。关于炎性细胞浸润，目前已有较多研究证实[5-6]，而促纤维蛋白溶解的溶栓治疗方法，存在严重出血不良反应如近期脑出血及胃肠活动性溃疡等用药禁忌。该研究旨在关注上述第3点：促进新血管生成，其对血栓消退的重要性已得到广泛认可[7-9]。脐带间充质干细胞具有归巢至缺血、损伤部位，并在局部建立促血管生成微环境，促进血管新生的特性[10-12]。研究发现其移植后能显著提高损伤部位微血管数量，增加局部血流灌注，而加快伤口愈合或促进器官功能恢复[13-14]，并已用于如脑脊髓损伤[15-17]、下肢缺血[18]、皮肤溃疡等动物模型的移植治疗[19]，但将其用于深静脉血栓的研究尚未见相关报道。实验结合人脐带间充质干细胞的促血管新生特性，从增加血栓内小血管数量的目标入手，探讨人脐带间充质干细胞移植治疗深静脉血栓的效果，为干细胞移植治疗血栓提供一定的理论基础和前期研究依据。1 材料和方法 Materials and 设计 随机对照动物实验 时间及地点 于2018年3月至11月在南通大学附属医院妇产科实验室及南通大学医学院动物实验中心完成 材料 SPF级雄性SD大鼠20只，体质量200-250 g，购自南通大学动物实验中心，许可证编号：SCXK(苏)2004-0001。实验方案经南通大学动物实验伦理委员会批准，批准号为-001，批准时间2018-04- 实验方法1.4.1 人脐带间充质干细胞的培养及鉴定 参考课题组前期实验方法[20]，如下：人脐带间充质干细胞培养细胞来源： 人脐带间充质干细胞来源于南通大学附属医院妇产科提取方法： 取健康足月剖宫产脐带，取材过程注意无菌，剔除1条脐静脉、2条脐动脉，剥离华通氏胶，并剪成1 mm×1 mm×1 mm块状。接种于含12 mL培养基细胞培养基： 培养基：50 mL培养基=45 mL的DMEM-F12(Hyclone公司)+5 mL胎牛血清(ExCell Biology，Inc.)+300 μL青霉素-链霉素溶液(碧云天公司)的T75CM透气培养瓶中细胞传代： 初3 d尽量减少移动和震荡，以利其贴壁，随后根据细胞生长情况换液和传代，期间部分P1代细胞冻存细胞鉴定： 倒置显微镜观察细胞形态1.4.2 构建下腔静脉血栓模型大鼠 实验大鼠术前12 h禁食水，按体积分数10%水合氯醛3.5 mL/kg的剂量腹腔注射麻醉。待麻醉平稳后，术区备皮、消毒，腹部正中做1个3 cm竖切口，逐层开腹，参考中国学者已发表的相关静脉血栓模型建立的手术经验和技巧[21]，暴露和分离肾静脉以下至髂静脉以上平面的下腔静脉及其属支，见图1。用5-0不可吸收缝线(宁波市成和显微器械厂)结扎此段下腔静脉的属支，之后取左肾静脉以下约2 mm处作为下腔静脉结扎点，钝性分离该处黏膜，于该结扎点的下腔静脉下方横行穿过5-0不可吸收缝线，另取1根4-0缝线(宁波市成和显微器械厂)与下腔静脉主干并行，在5-0缝线打结后抽出与下腔静脉并行的4-0缝线。待见结扎远端局部充血，血管颜色变暗，即认为建模成功，再逐层关腹。切口涂抹红霉素软膏，术后自由食?分组及干预 按随机数字法将深静脉血栓模型大鼠20只随机分为4组：对照组、实验组1、实验组2及实验组3，每组5只。将培养至80%-90%融合的P3代人脐带间充质干细胞消化、计数，重悬于PBS中，制成2× 109L-1浓度的细胞悬液，置于冰上备用。对照组：建模后第1，2，3天，尾静脉注射PBS 1 mL；实验组1：术后第1天，尾静脉注射脐带间充质干细胞悬液1 mL，第2，3天注射PBS 1 mL；实验组2：术后第1，2天尾静脉注射脐带间充质干细胞悬液1 mL，第3天注射PBS 1 mL；实验组3：术后第1，2，3天尾静脉注射脐带间充质干细胞悬液1 mL。整个实验过程中密关注射前后各组大鼠活力及状?标本取材 各组均于建模后第7天，按原切口再次进腹，并心脏取血(血标本离心取上清存于-80 ℃备用)，暴露腹腔，阻断下腔静脉血栓近端、远端血流，取出该段含血栓的下腔静脉，取出后谨慎游离与之粘连的主动脉、周围结缔组织，注意勿将静脉管腔暴力撕拉损坏，剪去多余组织。置于40 g/L多聚甲醛固定12-24 h，梯度脱水，石蜡包埋，包埋时注意使管腔横截面为切面，5 μm连续切片，漂片及烤?苏木精-伊红染色 切片常规脱蜡、水化后，使用苏木精-伊红和染色试剂盒(Solarbio公司)内苏木精染色5 min，分化液分化30 s，自来水慢冲30 min，伊红染色30 s，梯度乙醇脱水，透明，中性树胶封固。将组织置于视野中央，采取40倍视野下图像，采用Image J图像分析系统分析图像。切片为血栓的横截面，按以下公式计算各组血栓溶解率：溶解率=[(静脉管腔面积-血栓面积)/静脉管腔面积]×100% CD34免疫组织化学染色 CD34是毛细血管内皮细胞表面抗原，并且其不在人脐带间充质干细胞中表达，可将血栓内小血管染成棕褐色。切片常规脱蜡、水化，置于抗原修复液中在微波炉中加热至沸腾，自然冷却至室温，PBS冲洗5 min×3次，阻断内源性过氧化物酶(通用二步法检测试剂盒，中杉金桥公司)，滴加一抗(兔抗CD34抗体，Acbcam公司)室温孵育1 h，PBS冲洗5 min×3次，滴加反应增强液，室温下孵育20 min，PBS冲洗5 min×3次，滴加增强酶标二抗室温下孵育20 min，PBS冲洗5 min×3次，滴加新鲜配制的DAB显色液(DAB显色试剂盒，中杉金桥公司)室温孵育5 min，自来水冲洗5 min。苏木精复染15 s，流水冲洗，分化液中3 s，流水继续冲洗5 min。脱水，透明，封固。低倍镜视野下整体观察血栓内血管新生情况。取40倍视野左上、左下、右上及右下4个点分别转换成400倍视野计数该区域内新生血管数，采集各点区域时，管腔比作近似圆形，以视野对角线作为圆形直径，使得视野的顶点落在圆形的切点，以保证各次采集均为各血栓内相应的4个角落区域，将上述4个计数结果取平均值，计为该血栓的血管密度(个/400倍视野) 主要观察指标 ①各组血栓内新生血管密度；②各组血栓的溶解率1.6 统计学分析 采用SPSS 23.0软件进行统计分析。计量资料采用±s表示。组间数据差异比较采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey-Kramer事后检验，以P< 0.05表示差异有显著性意义。2 结果 实验动物数量分析 对照组在术后第2天死亡1只，实验组1其中1只在注射干细胞时，出现注射完毕即反应差、随后呼吸心跳骤停的情况，考虑系该次注射前未混匀细胞悬液，细胞团造成大鼠肺栓塞，后每次注射细胞前均使用口径较大的吸管轻柔吹打、混匀，未再次出现此类情况。最终18只大鼠进入结果分析 人脐带间充质干细胞培养结果及其形态学特点 培养三四天可见少量细胞从组织边缘爬出，多呈圆点状，见图2A；培养6 d进一步增多；培养8 d后见爬出明显增多，细胞由原来的圆状变成短棒状、有突起的长梭状，见图2B；培养13 d后细胞已有部分成片聚集，细胞多呈长梭状，偶扁平形的成纤维样细胞状，此时去掉组织块；培养16 d细胞浓度融合达80%-90%，低倍镜下见呈旋涡生长，见图2C。传代后细胞增长明显加快，P1代需每隔三四天换液1次，8 d后需1∶3传代。P2代细胞培养两三天即需换液，到第6天后需1∶4传代。若细胞浓度较低时常呈扁平样、多角样；若细胞浓度较高，趋于融合，常在低倍镜下呈旋涡状生长，高倍镜下可见细胞呈长梭形的成纤维细胞样 苏木精-伊红染色结果及各组血栓溶解率的比较 苏木精-伊红染色切片40倍镜下可见，有核炎性细胞由周边向内部浸润，机化由血栓周边开始。对照组：偶在血栓与血管壁之间见少量溶解裂隙，血栓内基本无溶解，血栓基本充满管腔；实验组1：血栓与血管壁之间裂隙较对照组稍有增加，血栓内溶解仍有限；实验组2：血栓与血管壁之间以及血栓内溶解显著增加，较对照组及实验组1明显；实验组3：血栓周围及内部的溶解进一步增加，见图3。各组血栓溶解率：细胞移植组较对照组增加，实验组3大于实验组2大于实验组1，但差异无显著性意义(P=0.077)，见表 各组血栓内新生血管数的比较 CD34免疫组织化学染色显示，低倍镜下小血管多位于血栓周边，细胞移植组的血栓内新生血管数量明显多于对照组，见图4。高倍镜下可见被染成棕褐色的管腔样结构的纵切面及横切面，且部分管腔内可见红细胞，见图5。各组平均血管密度：不同处理组间血栓的血管密度差异有显著性意义(P< 0.01)；组间两两比较示实验组1的平均血管密度比对照组高1.00(个/ 400倍视野)(95%CI：-)，差异无显著性意义(P= 0.810)；实验组2的平均血管密度比对照组高3.65(个/400倍视野)(95%CI：)，差异有显著性意义(P=0.018)；实验组3的平均血管密度比对照组高6.35(个/400倍视野)(95%CI：)，差异有显著性意义(P<0.01)；实验组3的平均血管密度比实验组2高2.70(个/400倍视野)(95%CI：-)，差异无显著性意义(P=0.07)，见表1。图1 大鼠肾静脉以下至髂静脉以上平面的下腔静脉及其属支形态Figure 1 Inferior vena cava and its tributaries below the renal vein and above the iliac vein in rats图注：粗箭头示下腔静脉的属支，予完全结扎；细箭头示距离左肾静脉以下约2 mm处，作为下腔静脉结扎点。RV：肾静脉。图2 镜下观察原代培养的人脐带华通氏胶间充质干细胞Figure 2 Primary cultured human umbilical cord mesenchymal stem cells under microscope图注：图 A为原代培养三四天后能看到少量细胞从组织边缘爬出，多呈圆点状(×100)；B为培养8 d后见爬出明显增多，细胞变成短棒状、有突起的长梭状(×100)；C为培养16 d后细胞融合达80%-90%，低倍镜下见呈旋涡生长，此时予以传代(×40)。图3 各组大鼠深静脉血栓组织切片苏木精-伊红染色结果(×40)Figure 3 Hematoxylin-eosin staining of deep vein thrombosis of rats in each group (×40)图注：图A为对照组，偶在血栓与血管壁之间见少量溶解裂隙，血栓基本充满管腔；图B为实验组1，血栓与血管壁之间裂隙较对照组稍有增加，但血栓溶解仍有限；图C为实验组2：血栓与血管壁之间以及血栓内溶解显著增加，较对照组及实验组1明显；图D为实验组3：血栓周围及内部的溶解进一步增加。VW：静脉管壁；T：血栓组织。图4 各组大鼠深静脉血栓组织切片CD34免疫组织化学染色形态(×40)Figure 4 CD34 immunohistochemical staining of deep vein thrombosis of rats in each group (×40)图注：图A为对照组；B为实验组1；C为实验组2；D为实验组3。低倍镜下可见小血管多位于血栓周边，细胞移植组的血栓内新生血管数量明显多于对照组。箭头所示为被CD34染成棕褐色的小血管。图5 血栓内小血管(CD34免疫组织化学染色，×400)Figure 5 The microvessels in the thrombosis (CD34 immunohistochemical staining, ×400)图注：图A-D分别为为血栓左上角、右上角、左下角及右下角。箭头示血栓内小血管被染成棕褐色，可见管腔的纵切面及横切面，部分管腔内可见红细胞。表1 各组大鼠血栓血管密度及溶解率对比 (±s)Table 1 Comparison of vascular density and dissolution rate among groups表注：不同处理组间血栓的溶解率差异无显著性意义(P=0.077)；不同处理组间血栓的血管密度差异具有显著性意义(P< 0.001)。组别n血管密度(个/400倍视野) 溶解率(%)对照组 4 8. 5.实验组 1 4 9. 6.实验组 2 5 11. 8.实验组 3 5 14. 9.值14.899 2.822P值< 0.001 0.0773 讨论 血管新生对血栓机化的影响 血栓机化的本质即是由肉芽组织逐渐取代血栓的过程，新血管的形成发挥重要作用，这不仅有利于肉芽组织的存活，亦能增加单核细胞、炎性因子向局部的募集[22]，并且这些新形成的小血管与体循环相通，可以恢复局部血流[23-24]。此外，国内有研究者发现在大鼠下腔静脉血栓模型建立7 d后，血栓机化和新生毛细血管明显，而在之后则变化缓慢[25]。所以该实验选择在第7天进行血管计数，并通过计算血栓横切面上单位面积的小血管数量，发现移植了人脐带间充质干细胞的实验2组和实验3组新生血管数明显增多，认为人脐带间充质干细胞移植能增加血栓内血管新生，而促进机化。通过计算剩余血栓面积占静脉管腔比值，发现移植细胞组与对照组无明显差异，认为人脐带间充质干细胞移植对血栓溶解及管腔再通无显著作用 人脐带间充质干细胞的促血管新生特性 目前关于人脐带间充质干细胞促血管新生的确切机制仍在研究中，主要认为有两方面作用：①间充质干细胞分化为内皮细胞，参与构成新生血管。但这方面尚存在争议，Aguilera等[26]研究结果认为脐带沃顿氏胶间充质干细胞可以分化为内皮细胞，并且显著促进了伤口处血管生成及肉芽组织生长。但是，亦有研究者提出反对意见，认为其促血管新生主要依靠旁分泌作用，而直接分化作用很小[27-28]；②脐带间充质干细胞的旁分泌功能。这方面已有广泛认可，研究发现其能分泌血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及肝细胞生长因子等生物活性分子，而建立促血管新生微环境，对新血管生成和微血管网络形成发挥重要作用[29-31]。但无论精确的机制如何，间充质干细胞促血管新生的特性已在较多缺血动物模型中得到应用。Zhu等[32]通过构建缺血性脑卒中大鼠模型，发现人脐带间充质干细胞的移植能显著提高局部血流灌注，并促进了神经功能恢复。在促进伤口愈合的相关研究中，发现间充质可以通过增加毛细血管样管腔数量促进肉芽组织存活来加快伤口愈合[33-35]。但是，目前将人脐带间充质干细胞用于血栓的研究尚未见报道。该实验即利用脐带间充质干细胞的促血管生成特性，结合血栓机化、溶解及再通过程需要新血管生成在这一特点，提出间充质干细胞可能有助于血栓机化、溶解及再通的设想。该实验发现一定剂量的人脐带间充质干细胞移植能显著增加血栓内的小血管数目，从而有助于血栓机化；但对血栓的溶解和管腔再通无效。但需承认，观察血栓溶解及血管再通的金标准系DSA，实验仅计算血栓横切面上小血管数目及存留血栓面积的大小，故存在其局限性，所得结论亦相对较保守，但目前得到的这些结果是值得课题组在该方面进一步探究的。因此，实验结果为脐带间充质干细胞的促血管生成特性增加了动物实验证据，并为进一步研究间充质干细胞对静脉血栓的治疗作用探索了初步研究基础。4 参考文献 References[1] Vedovetto V, Dalla Valle F, Milan M, et al. 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