人脐带间充质干细胞移植治疗大鼠深静脉血栓(2) - 湖北农机化杂志社投稿

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人脐带间充质干细胞移植治疗大鼠深静脉血栓(2)

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1.4.3 分组及干预按随机数字法将深静脉血栓模型大鼠20只随机分为4组：对照组、实验组1、实验组2及实验组3，每组5只。将培养至80%-90%融合的P3代人脐带间充质干细胞消化、计数，重悬于PBS中，制成2× 109 L-1浓度的细胞悬液，置于冰上备用。对照组：建模后第1，2，3天，尾静脉注射PBS 1 mL；实验组1：术后第1天，尾静脉注射脐带间充质干细胞悬液1 mL，第2，3天注射PBS 1 mL；实验组2：术后第1，2天尾静脉注射脐带间充质干细胞悬液1 mL，第3天注射PBS 1 mL；实验组3：术后第1，2，3天尾静脉注射脐带间充质干细胞悬液1 mL。整个实验过程中密关注射前后各组大鼠活力及状态。

1.4.4 标本取材各组均于建模后第7天，按原切口再次进腹，并心脏取血(血标本离心取上清存于-80 ℃备用)，暴露腹腔，阻断下腔静脉血栓近端、远端血流，取出该段含血栓的下腔静脉，取出后谨慎游离与之粘连的主动脉、周围结缔组织，注意勿将静脉管腔暴力撕拉损坏，剪去多余组织。置于40 g/L多聚甲醛固定12-24 h，梯度脱水，石蜡包埋，包埋时注意使管腔横截面为切面，5 μm连续切片，漂片及烤片。

1.4.5 苏木精-伊红染色切片常规脱蜡、水化后，使用苏木精-伊红和染色试剂盒(Solarbio公司)内苏木精染色5 min，分化液分化30 s，自来水慢冲30 min，伊红染色30 s，梯度乙醇脱水，透明，中性树胶封固。将组织置于视野中央，采取40倍视野下图像，采用Image J图像分析系统分析图像。切片为血栓的横截面，按以下公式计算各组血栓溶解率：溶解率=[(静脉管腔面积-血栓面积)/静脉管腔面积]×100%。

1.4.6 CD34免疫组织化学染色 CD34是毛细血管内皮细胞表面抗原，并且其不在人脐带间充质干细胞中表达，可将血栓内小血管染成棕褐色。切片常规脱蜡、水化，置于抗原修复液中在微波炉中加热至沸腾，自然冷却至室温，PBS冲洗5 min×3次，阻断内源性过氧化物酶(通用二步法检测试剂盒，中杉金桥公司)，滴加一抗(兔抗CD34抗体，Acbcam公司)室温孵育1 h，PBS冲洗5 min×3次，滴加反应增强液，室温下孵育20 min，PBS冲洗5 min×3次，滴加增强酶标二抗室温下孵育20 min，PBS冲洗5 min×3次，滴加新鲜配制的DAB显色液(DAB显色试剂盒，中杉金桥公司)室温孵育5 min，自来水冲洗5 min。苏木精复染15 s，流水冲洗，分化液中3 s，流水继续冲洗5 min。脱水，透明，封固。低倍镜视野下整体观察血栓内血管新生情况。取40倍视野左上、左下、右上及右下4个点分别转换成400倍视野计数该区域内新生血管数，采集各点区域时，管腔比作近似圆形，以视野对角线作为圆形直径，使得视野的顶点落在圆形的切点，以保证各次采集均为各血栓内相应的4个角落区域，将上述4个计数结果取平均值，计为该血栓的血管密度(个/400倍视野)。

1.5 主要观察指标 ①各组血栓内新生血管密度；②各组血栓的溶解率

1.6 统计学分析采用SPSS 23.0软件进行统计分析。计量资料采用±s表示。组间数据差异比较采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey-Kramer事后检验，以P < 0.05表示差异有显著性意义。

2 结果 Results

2.1 实验动物数量分析对照组在术后第2天死亡1只，实验组1其中1只在注射干细胞时，出现注射完毕即反应差、随后呼吸心跳骤停的情况，考虑系该次注射前未混匀细胞悬液，细胞团造成大鼠肺栓塞，后每次注射细胞前均使用口径较大的吸管轻柔吹打、混匀，未再次出现此类情况。最终18只大鼠进入结果分析。

2.2 人脐带间充质干细胞培养结果及其形态学特点培养三四天可见少量细胞从组织边缘爬出，多呈圆点状，见图2A；培养6 d进一步增多；培养8 d后见爬出明显增多，细胞由原来的圆状变成短棒状、有突起的长梭状，见图2B；培养13 d后细胞已有部分成片聚集，细胞多呈长梭状，偶扁平形的成纤维样细胞状，此时去掉组织块；培养16 d细胞浓度融合达80%-90%，低倍镜下见呈旋涡生长，见图2C。传代后细胞增长明显加快，P1代需每隔三四天换液1次，8 d后需1∶3传代。P2代细胞培养两三天即需换液，到第6天后需1∶4传代。若细胞浓度较低时常呈扁平样、多角样；若细胞浓度较高，趋于融合，常在低倍镜下呈旋涡状生长，高倍镜下可见细胞呈长梭形的成纤维细胞样。

2.3 苏木精-伊红染色结果及各组血栓溶解率的比较苏木精-伊红染色切片40倍镜下可见，有核炎性细胞由周边向内部浸润，机化由血栓周边开始。对照组：偶在血栓与血管壁之间见少量溶解裂隙，血栓内基本无溶解，血栓基本充满管腔；实验组1：血栓与血管壁之间裂隙较对照组稍有增加，血栓内溶解仍有限；实验组2：血栓与血管壁之间以及血栓内溶解显著增加，较对照组及实验组1明显；实验组3：血栓周围及内部的溶解进一步增加，见图3。各组血栓溶解率：细胞移植组较对照组增加，实验组3大于实验组2大于实验组1，但差异无显著性意义(P=0.077)，见表1。

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